发布日期：2022-07-29浏览次数：872来源：蓝景科信
本文概要
目前，关于健康个体与年龄相关的miRNA及其与mRNA相互作用的知识还比较缺乏。于是，科学家们研究了健康人的气道中与年龄相关的mRNA和miRNA的表达变化及其相互作用关系。对86名健康个体(年龄：18-73岁)的支气管活检样品进行RNA测序和miRNA测序，以确定与年龄相关的基因表达变化。根据每个与年龄相关的miRNA，确定了与年龄相关的预测靶点的富集程度及相关性。最终鉴定出285个与年龄相关的基因和27个与年龄相关的miRNAs。Pathway富集表明，随着年龄增长而表达上调的基因主要参与突触相关过程。随着年龄增长而表达下调的基因主要参与细胞周期调节、免疫系统和DNA损伤修复过程。MiR-146a-5p、miR-146b-5p和miR-142-5p随着年龄增长而表达下调，而这些miRNAs的预测靶基因在随年龄增长而表达上调的基因中得到显著富集。预测靶基因RIMS2和IGSF1的表达与miR-146a-5p和miR-146b-5p的表达均呈负相关。富集结果显示RIMS2可以正向调控突触传递。总之，随着衰老而表达下降的基因主要与一些衰老特征有关。随着年龄增长而表达上调的基因主要参与突触相关的过程，其中RIMS2可能受到两个与年龄相关的miRNAs的调控。
研究背景
从古至今，衰老一直是每个人都迫切关心的问题之一。从生理层面来看，衰老是生物体内稳态逐渐下降的过程，会导致机体发生疾病或死亡的风险增加。在正常的衰老过程中，肺功能随着时间的推移而下降，包括胸腔变小、呼吸肌肉功能降低、老年性肺气肿和黏液清除率减少。
目前，关于衰老导致的气道变化的知识，已知的还很少。
此前，有研究表明，随着年龄增长，气道壁厚度减少；一项小鼠的研究还表明，气道祖细胞的衰老会损害气道再生。基因和miRNA表达的变化可能在肺的衰老相关过程中发挥作用。为了深入了解这些过程，已经进行了一些基因和miRNA表达研究。此前，科学家在肺组织中发现了3,509个与年龄相关的基因，这些基因参与了肺的发育，细胞-细胞接触，钙信号传导和免疫反应。Dugo等人发现，在肺组织中217个与年龄相关的基因中，涉及细胞外基质产生和功能、促炎症反应和伤口愈合过程。多种miRNAs被认为参与了衰老过程，特别是在细胞衰老过程。此外，DNA损伤和氧化应激可诱导人胎肺成纤维细胞中miR-210和miR-494的表达。这些miRNAs通过一个正反馈回路诱导DNA损伤和氧化应激。
虽然一些基因和miRNAs被认为参与了肺器官的衰老，但关于潜在的与年龄相关的mRNA-miRNA相互作用的信息被发现的还较少。此外，到目前为止，还未对肺功能正常和无呼吸系统疾病的健康受试者进行过研究。
研究目的
在本研究中，科学家旨在确定健康人的支气管活检样品中与年龄相关的mRNA和miRNA的表达变化及其相互作用。
研究结果
1. 受试者特征
本研究中的样本来自于86例健康人（年龄：18-73岁）的支气管活检（表1）。由于质控，最终有77个RNA测序数据和82个小RNA测序数据用于做后续分析。其中73例受试者同时有mRNA和小RNA测序数据。
表1. 受试者特征的统计情况
2. 人支气管活检样品中年龄相关基因的表达变化
在转录组表达谱中发现285个与年龄相关的基因表达水平改变(FDR adj p<0.05)。其中，随着年龄增加有149个基因表达增高和136个基因表达降低。上调表达的前3个基因分别是TMTC1，CPS1和RP11-550F7.1；下调表达的前3个基因分别是TIMELESS,，KNTC1和BRIP1。
图1. 健康人支气管活检样品中与年龄相关的基因表达谱
3. 肺组织中年龄相关基因的重复性得到验证
在与年龄有关的149个上调表达基因和136个下调表达基因中，分别有117和118个基因在之前研究中已经有过报道。本次研究中，分别有117个上调表达基因中的58个和118个下调表达基因中的43个得到了重复验证。出现这种不能完全重复的情况可能有多种原因，其中很重要的一个原因就是受试者和样本来源的不同，先前研究中存在肺疾病患者和对照组肺功能正常者的肺组织样品，而本研究中采用的都是健康人的支气管活检样品。
4. 年龄相关基因的生物学过程和通路富集分析
生物学过程和通路分析分别显著地富集到115和116个与年龄相关的过程和通路。随着年龄的增长，上调表达基因在突触相关过程(n=19基因)和肌肉收缩相关通路(n=8基因)中富集。随着年龄，下调表达基因在细胞周期(n=54基因)、免疫系统(n=44基因)和DNA损伤和修复(n=25基因)相关过程和通路中富集。
5. 支气管活检样品中年龄相关miRNAs的表达变化
发现27个与年龄相关的miRNA表达发生变化，其中13个miRNAs下调表达和14个miRNAs上调表达。与年龄相关的前3个上调表达miRNAs分别是miR-3195，miR-1247-5p和miR-1-3p；前3个下调表达基因分别是miR-146b-5p，miR-155-5p和miR-20a-5p。
图2. 健康人支气管活检样品中与年龄相关的miRNAs表达谱
6. 与年龄相关的miRNAs靶基因的富集分析
为了确定年龄相关mRNA和miRNA表达变化之间的潜在相互作用，进一步确定了与所有表达基因相比，年龄相关miRNA的预测靶基因是否在随年龄增加表达量升高或将低的基因中富集。在随着年龄增长而表达下调的13个miRNAs中，miR-146b-5p、miR-142-5p和miR-146a-5p预测靶基因在随着年龄增长而表达升高的基因中有显著富集( (p<0.05))，miR-409-3p也观察到类似的趋势(p=0.098，图3)。MiR-146b-5p、miR-142-5p和miR-146a-5p分别有5、16和5个预测靶基因随着年龄增加而表达上调。在随着年龄增长而表达下调的14个miRNAs中，预测的靶基因在随着年龄增长而表达下降的基因中没有被显著富集。
图3. 年龄相关miRNAs靶基因的富集分析
7. miR-146b-5p, miR-142-5p and miR-146a-5与其靶基因的相关性分析
为了进一步证实年龄相关基因和miRNAs表达变化之间的联系，科学家评估了miR-146b-5p、miR-142-5p和miR-146a-5p表达与其富集到的随着年龄增长而表达上调的靶基因之间的相关性。发现了3个miRNAs与其与年龄相关的预测靶基因之间存在9个显著的负相关关系（图4）。对于miR-146b-5p其与年龄相关的5个预测靶基因中的4个存在显著的负相关。对于miR-142-5p和miR-146a-5p，分别有16个基因中3个和5个基因中的2个均呈负相关关系。9个显著的负相关性共涉及7个不同的靶基因。其中，RIMS2和IGSF1与miR-146b-5p和miR-146a-5p均呈负相关。在随年龄增长而表达上调的基因中，RIMS2是排在显著高表达基因的第4位，而IGSF1是第6位。
图4. miRNA表达和其与年龄相关的预测靶基因表达的相关性
本研究中用到了PerkinElmer品牌的LabChip GX核酸分析仪和Sciclone NGS工作站，以及PerkinElmer旗下Bioo Scientific品牌的NEXTflex Small RNA-seq kit V3试剂盒。
LabChip® GX Touch™
Sciclone ® G3 NGSx iQ™
Sciclone ® G3 NGSx
NEXTFLEX® Library Prep Kits
LabChip® GX Touch核酸分析仪采用微流控毛细管电泳分离技术可以快速完成DNA和RNA样品的完整度评估和全面质控分析，确保只有合格的样品用于下游分析检测。
Sciclone® G3 NGSx液体处理工作站被专门设计用于高通量、无人值守的NGS文库制备。台面设计和直观的用户界面，避免了交叉污染和用户误操作。此外Sciclone G3 NGSx高通量测序文库制备工作站预装配套、经验证的几十种文库自动化制备程序，包括但不限于全基因组测序、RNA测序、染色质免疫沉淀测序（ChIPseq）、靶向测序和扩增子测序，可供您灵活选择。这些友好的自动化文库制备方法程序，确保您在装机后一周内就可运行实际样品，获得理想结果。现如今，PerkinElmer可以提供从核酸提取到数据分析的全流程解决方案，包括样品分离、核酸提取、文库制备、样品定量、测序和分析。
NEXTflex Small RNA-seq kit V3试剂盒提供免切胶或低起始样本量两种方案进行Small RNA文库制备，可适用于Illumina平台。当样品起始量为≥200 ng的总RNA时，Small RNA建库可通过减少接头二聚体的方式完全免除凝胶纯化过程。与此同时，文库制备的样本起始量可少至1ng总RNA，增加PCR循环数，获得无接头二聚体的文库(低起始样本量时，需要切胶纯化)。另外，该款试剂盒在连接步骤中使用随机性接头以减少连接偏差，相比传统的方法而言，大大减少了偏差的产生。数据中偏差的减少，更加准确的反应出起始材料中 Small RNA的丰度。此外，还能够在更少的总reads数中检测到更多的miRNAs，提高Small RNA的测序效率，降低测序成本。
参考文献：
Ong, J., Woldhuis, R. R., Boudewijn, I. M., et al. 2019. Age-related gene and miRNA expression changes in airways of healthy individuals. Scientific Reports,9(1). doi:10.1038/s41598-019-39873-0.
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