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酵母双杂交

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酵母双杂交常见问题


1. 酵母双杂交系统应用

A. 鉴定蛋白新功能

B. 细胞内研究抗原抗体相互作用

C. 筛选药物作用位点

D. 构建基因组蛋白连锁图

 

2. 酵母双杂交技术有什么优势?

A. 体内或验证,无需蛋白表达、纯化等步骤;

B. 细胞内验证,一定程度上反映细胞内的真实情况;

C. 可检测微弱的蛋白相互作用;

D. 可对不同组织、器官、细胞、分化阶段材料进行文库构建和筛选

 

3. 如何确定是选择构建和体系文库还是模体系文库?

如果诱饵基因是定位在膜上的蛋白则选择膜体系文库,如果诱饵基因定位于细胞核则选择和体系文库。

 

4. 若诱饵蛋白可直接激活报告基因表达,如何应对?

该蛋白有可能是转录因子,包含转录激活域。可通过基因重组切掉转录激活域,然后重新检测是否依然自激活。

 

5. 杂交效率不高怎么办?

在杂交中,预转化的幼儿细胞的数量可能不够。当对诱饵菌株进行液体培养过夜时,应挑选大的、新鲜的克隆进行培养,经过离心和重悬后,再使用血球计对细胞进行计数,提高杂交效率。

 

6. 酵母双杂交出现假阳性原因及解决方法

由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用,或者其激活作用被外来蛋白激活。AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合,这个可以单独激活报告基因的表达。因此需要做严格的对照试验,对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定,已排除假阳性。也可以采用多个报告基因,且每个报告基因的上游调控区各不相同,可以减少大量的假阳性。另外,报告基因整合到染色体上,可使基因表达水平稳定,消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。



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