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ChIP-seq(染色质免疫沉淀测序)技术服务

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ChIP-Seq常见问题


1. Input和IP样本之间的关系是什么?

Input和IP属于两个样本,在前期检测、建库、测序都是平行进行的,但是分析中需要将两个样本的测序数据进行整合分析,得出最终的peak结果,并进行后续分析。

2. Input是什么?有什么作用?

我们将DNA或者RNA片段化后,在进行免疫沉淀前,需要取一部分断裂后的染色质做Input对照(不进行免疫沉淀过程)。Input是断裂后的基因组DNA或者RNA,需要与沉淀后的样品DNA/RNA一起经过逆转交联,DNA/RNA纯化,以及最后的PCR或其他方法检测。通过后续数据分析,我们可以通过Input对照排除背景噪音(排除因本底表达水平高或一些非特异性结合所造成的假阳性peaks),验证染色质断裂的效果和整个实验中IP效果,所以Input对照是IP-seq实验必不可少的步骤。

3. 阳性对照和阴性对照是什么?

阳性对照

一般用anti-RNA polymerase II抗体,因为RNA polymerase II是通用转录因子,在所有细胞中都能结合基因的核心启动子区,因此理论上,ChIP后PCR会有条带。一般阳性对照不进行测序。

阴性对照

阴性对照分为mock和Input两种,二者均能起到减少假阳性的作用。mock:用普通IgG为抗体,理论上不会ChIP下来任何DNA片段,因此作为阴性对照,但是由于非特异性结合,或者实验过程,没发生结合的DNA清楚不完全,可能会出现条带,但是一般条带亮度较弱。IgG不需要进行测序,只是判断IP试验中所选取的抗体是否特异。

 

4. ChIP-seq的推荐测序数据量是多少?是否需要设置重复?

一般来说,ChIP得到的DNA片段丰富度较低,大数据量测序意义不大。按照ENCODE目前标准:转录因子建议有20 M以上的可用reads;不同组蛋白标准不一,基本在20 M-45 M可用reads。

ChIP-seq的实验过程较为复杂,早期文章中往往缺少重复样本的设置。不过为了提高文章结论的可信度,目前的分析标准中通常推荐有2个以上的生物学重复;对于样本较难获得的情况,可以不设置生物学重复。

 

5. ChIP实验中使用的对照样本是否也需要测序?需要哪些对照?

ChIP富集中常见的对照包括:

1)input,片段化后未经抗体富集的染色质后期去蛋白得到的DNA;

2)阳性对照,利用普通组蛋白或RNA聚合酶等阳性蛋白抗体进行免疫沉淀得到的DNA;

3)阴性对照,免疫沉淀过程中不加入抗体或者加入非特异性IgG抗体得到的DNA。

其中,input在数据分析时用于除去背景、进行检峰,是必须要进行建库测序的样本;阳性对照所用抗体与目标蛋白无关,不必进行建库测序;阴性对照理论上基本不会捕获到足量DNA,无法进行建库测序。



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