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LabChip GX Touch核酸分析仪、Sciclone G3 NGS液体处理工作站助力基因测序研究

发布日期:2022-07-29浏览次数:122来源:蓝景科信

本文概要


目前,关于健康个体与年龄相关的miRNA及其与mRNA相互作用的知识还比较缺乏。于是,科学家们研究了健康人的气道中与年龄相关的mRNA和miRNA的表达变化及其相互作用关系。对86名健康个体(年龄:18-73岁)的支气管活检样品进行RNA测序和miRNA测序,以确定与年龄相关的基因表达变化。根据每个与年龄相关的miRNA,确定了与年龄相关的预测靶点的富集程度及相关性。最终鉴定出285个与年龄相关的基因和27个与年龄相关的miRNAs。Pathway富集表明,随着年龄增长而表达上调的基因主要参与突触相关过程。随着年龄增长而表达下调的基因主要参与细胞周期调节、免疫系统和DNA损伤修复过程。MiR-146a-5p、miR-146b-5p和miR-142-5p随着年龄增长而表达下调,而这些miRNAs的预测靶基因在随年龄增长而表达上调的基因中得到显著富集。预测靶基因RIMS2和IGSF1的表达与miR-146a-5p和miR-146b-5p的表达均呈负相关。富集结果显示RIMS2可以正向调控突触传递。总之,随着衰老而表达下降的基因主要与一些衰老特征有关。随着年龄增长而表达上调的基因主要参与突触相关的过程,其中RIMS2可能受到两个与年龄相关的miRNAs的调控。


研究背景


从古至今,衰老一直是每个人都迫切关心的问题之一。从生理层面来看,衰老是生物体内稳态逐渐下降的过程,会导致机体发生疾病或死亡的风险增加。在正常的衰老过程中,肺功能随着时间的推移而下降,包括胸腔变小、呼吸肌肉功能降低、老年性肺气肿和黏液清除率减少。

目前,关于衰老导致的气道变化的知识,已知的还很少。

此前,有研究表明,随着年龄增长,气道壁厚度减少;一项小鼠的研究还表明,气道祖细胞的衰老会损害气道再生。基因和miRNA表达的变化可能在肺的衰老相关过程中发挥作用。为了深入了解这些过程,已经进行了一些基因和miRNA表达研究。此前,科学家在肺组织中发现了3,509个与年龄相关的基因,这些基因参与了肺的发育,细胞-细胞接触,钙信号传导和免疫反应。Dugo等人发现,在肺组织中217个与年龄相关的基因中,涉及细胞外基质产生和功能、促炎症反应和伤口愈合过程。多种miRNAs被认为参与了衰老过程,特别是在细胞衰老过程。此外,DNA损伤和氧化应激可诱导人胎肺成纤维细胞中miR-210和miR-494的表达。这些miRNAs通过一个正反馈回路诱导DNA损伤和氧化应激。

虽然一些基因和miRNAs被认为参与了肺器官的衰老,但关于潜在的与年龄相关的mRNA-miRNA相互作用的信息被发现的还较少。此外,到目前为止,还未对肺功能正常和无呼吸系统疾病的健康受试者进行过研究。


研究目的


在本研究中,科学家旨在确定健康人的支气管活检样品中与年龄相关的mRNA和miRNA的表达变化及其相互作用。

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研究结果


1. 受试者特征

本研究中的样本来自于86例健康人(年龄:18-73岁)的支气管活检(表1)。由于质控,最终有77个RNA测序数据和82个小RNA测序数据用于做后续分析。其中73例受试者同时有mRNA和小RNA测序数据。

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表1. 受试者特征的统计情况


2. 人支气管活检样品中年龄相关基因的表达变化

在转录组表达谱中发现285个与年龄相关的基因表达水平改变(FDR adj p<0.05)。其中,随着年龄增加有149个基因表达增高和136个基因表达降低。上调表达的前3个基因分别是TMTC1,CPS1和RP11-550F7.1;下调表达的前3个基因分别是TIMELESS,,KNTC1和BRIP1。

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图1. 健康人支气管活检样品中与年龄相关的基因表达谱


3. 肺组织中年龄相关基因的重复性得到验证

在与年龄有关的149个上调表达基因和136个下调表达基因中,分别有117和118个基因在之前研究中已经有过报道。本次研究中,分别有117个上调表达基因中的58个和118个下调表达基因中的43个得到了重复验证。出现这种不能完全重复的情况可能有多种原因,其中很重要的一个原因就是受试者和样本来源的不同,先前研究中存在肺疾病患者和对照组肺功能正常者的肺组织样品,而本研究中采用的都是健康人的支气管活检样品。


4. 年龄相关基因的生物学过程和通路富集分析

生物学过程和通路分析分别显著地富集到115和116个与年龄相关的过程和通路。随着年龄的增长,上调表达基因在突触相关过程(n=19基因)和肌肉收缩相关通路(n=8基因)中富集。随着年龄,下调表达基因在细胞周期(n=54基因)、免疫系统(n=44基因)和DNA损伤和修复(n=25基因)相关过程和通路中富集。


5. 支气管活检样品中年龄相关miRNAs的表达变化

发现27个与年龄相关的miRNA表达发生变化,其中13个miRNAs下调表达和14个miRNAs上调表达。与年龄相关的前3个上调表达miRNAs分别是miR-3195,miR-1247-5p和miR-1-3p;前3个下调表达基因分别是miR-146b-5p,miR-155-5p和miR-20a-5p。

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图2. 健康人支气管活检样品中与年龄相关的miRNAs表达谱


6. 与年龄相关的miRNAs靶基因的富集分析

为了确定年龄相关mRNA和miRNA表达变化之间的潜在相互作用,进一步确定了与所有表达基因相比,年龄相关miRNA的预测靶基因是否在随年龄增加表达量升高或将低的基因中富集。在随着年龄增长而表达下调的13个miRNAs中,miR-146b-5p、miR-142-5p和miR-146a-5p预测靶基因在随着年龄增长而表达升高的基因中有显著富集( (p<0.05)),miR-409-3p也观察到类似的趋势(p=0.098,图3)。MiR-146b-5p、miR-142-5p和miR-146a-5p分别有5、16和5个预测靶基因随着年龄增加而表达上调。在随着年龄增长而表达下调的14个miRNAs中,预测的靶基因在随着年龄增长而表达下降的基因中没有被显著富集。

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图3. 年龄相关miRNAs靶基因的富集分析


7. miR-146b-5p, miR-142-5p and miR-146a-5与其靶基因的相关性分析

为了进一步证实年龄相关基因和miRNAs表达变化之间的联系,科学家评估了miR-146b-5p、miR-142-5p和miR-146a-5p表达与其富集到的随着年龄增长而表达上调的靶基因之间的相关性。发现了3个miRNAs与其与年龄相关的预测靶基因之间存在9个显著的负相关关系(图4)。对于miR-146b-5p其与年龄相关的5个预测靶基因中的4个存在显著的负相关。对于miR-142-5p和miR-146a-5p,分别有16个基因中3个和5个基因中的2个均呈负相关关系。9个显著的负相关性共涉及7个不同的靶基因。其中,RIMS2和IGSF1与miR-146b-5p和miR-146a-5p均呈负相关。在随年龄增长而表达上调的基因中,RIMS2是排在显著高表达基因的第4位,而IGSF1是第6位。

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图4. miRNA表达和其与年龄相关的预测靶基因表达的相关性




本研究中用到了PerkinElmer品牌的LabChip GX核酸分析仪和Sciclone NGS工作站,以及PerkinElmer旗下Bioo Scientific品牌的NEXTflex Small RNA-seq kit V3试剂盒。

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LabChip® GX Touch™

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Sciclone ® G3 NGSx iQ™

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Sciclone ® G3 NGSx

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NEXTFLEX® Library Prep Kits


LabChip® GX Touch核酸分析仪采用微流控毛细管电泳分离技术可以快速完成DNA和RNA样品的完整度评估和全面质控分析,确保只有合格的样品用于下游分析检测。

Sciclone® G3 NGSx液体处理工作站被专门设计用于高通量、无人值守的NGS文库制备。台面设计和直观的用户界面,避免了交叉污染和用户误操作。此外Sciclone G3 NGSx高通量测序文库制备工作站预装配套、经验证的几十种文库自动化制备程序,包括但不限于全基因组测序、RNA测序、染色质免疫沉淀测序(ChIPseq)、靶向测序和扩增子测序,可供您灵活选择。这些友好的自动化文库制备方法程序,确保您在装机后一周内就可运行实际样品,获得理想结果。现如今,PerkinElmer可以提供从核酸提取到数据分析的全流程解决方案,包括样品分离、核酸提取、文库制备、样品定量、测序和分析。

NEXTflex Small RNA-seq kit V3试剂盒提供免切胶或低起始样本量两种方案进行Small RNA文库制备,可适用于Illumina平台。当样品起始量为≥200 ng的总RNA时,Small RNA建库可通过减少接头二聚体的方式完全免除凝胶纯化过程。与此同时,文库制备的样本起始量可少至1ng总RNA,增加PCR循环数,获得无接头二聚体的文库(低起始样本量时,需要切胶纯化)。另外,该款试剂盒在连接步骤中使用随机性接头以减少连接偏差,相比传统的方法而言,大大减少了偏差的产生。数据中偏差的减少,更加准确的反应出起始材料中 Small RNA的丰度。此外,还能够在更少的总reads数中检测到更多的miRNAs,提高Small RNA的测序效率,降低测序成本。


参考文献:

Ong, J., Woldhuis, R. R., Boudewijn, I. M., et al. 2019. Age-related gene and miRNA expression changes in airways of healthy individuals. Scientific Reports,9(1). doi:10.1038/s41598-019-39873-0.




蓝景科信(北京)技术有限公司(Bluescape Scientific CO.,LTD)是一家专业从事生命科学产品和技术开发、国际贸易的新型综合性科技公司。本公司拥有实力雄厚的研究技术团队,以严谨的科学态度,不断满足生命科学市场的需求。目前,本公司的产品主要应用于基因检测相关领域,通过自主研发与代理结合的模式,为客户提供从样品制备到数据分析的整体解决方案,包括核酸提取、捕获探针定制、自动化液体处理、NGS文库制备、DNA/RNA定量分析等,其中多项技术在国内得到广泛应用,服务于科学研究、食品安全、临床检测、农业育种等领域。致力于为基因检测领域客户提供全面深入的解决方案。

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